艾納香（Blumea balsamifera L），別名管芽，假東風(fēng)草[1]、大風(fēng)艾、大艾、冰片艾等，屬于菊科艾納香屬多年生木質(zhì)草本植物，在我國(guó)主要產(chǎn)于廣西、貴州、云南、廣東等省[2]，以其全草或地上部分入藥，具有鎮(zhèn)痛、發(fā)汗、祛風(fēng)除濕、去痰止咳、通經(jīng)止血等功效，是一種重要的民間藥物。作為天然中草藥，艾納香含有多種有效成分，已經(jīng)鑒定的有黃酮類(lèi)、有機(jī)酸、萜類(lèi)等[3-5]。同時(shí)，艾納香是天然龍腦的重要來(lái)源，艾納香精油中含30%左右龍腦[6]，是名貴藥材、香料、化妝品的原料及食品保健品的添加劑。 
　　艾納香屬多年生宿根植物，主要以宿根分株繁殖，分生苗移栽成活率低;艾納香利用種子育苗發(fā)現(xiàn)種子結(jié)實(shí)率低、休眠期長(zhǎng)、發(fā)芽率低[7，8]。這些情況導(dǎo)致艾納香種苗短缺，嚴(yán)重制約了艾納香的規(guī)模化生產(chǎn)，因此必須研究艾納香的組織培養(yǎng)以快速獲得批量種苗，擴(kuò)大種植規(guī)模以滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。此外，在進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，直接以組織培養(yǎng)物替代原藥材是解決艾納香資源短缺的重要方法。對(duì)不同培養(yǎng)條件下的艾納香中龍腦含量進(jìn)行比較，有利于擴(kuò)寬艾納香藥材的應(yīng)用，使這一古老的中藥為人類(lèi)健康發(fā)揮更大的作用。 
　　1  材料與方法 
　　1.1  儀器 
　　7890A/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent公司）。 
　　1.2  試劑 
　　龍腦對(duì)照品，無(wú)水乙醇。 
　　1.3  供試材料 
　　艾納香組培愈傷組織;艾納香組培苗由貴州民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)了7個(gè)月的組培苗;艾納香野生苗采自貴州羅甸縣。 
　　1.4  龍腦對(duì)照品溶液的制備 
　　稱(chēng)取龍腦對(duì)照品10 mg，置于10 mL的容量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并加至刻度，搖勻，即可得到濃度為1 mg/mL的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液;另取200、300、400、500、600 μL的貯備液，分別置于10 mL容量瓶中加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液備用，濃度分別為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL。 
　　1.5  氣質(zhì)聯(lián)用條件 
　　1.5.1  色譜條件  采用HP-5MS氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;進(jìn)樣口溫度為280 ℃，采用程序升溫，柱溫起始溫度為90 ℃，以5 ℃/min升溫至100 ℃，維持3 min;再以5 ℃/min升溫至150 ℃，維持2 min;分流比為40∶1;載氣為高純氦氣，載流速度為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為1.0 μL。1.5.2  質(zhì)譜條件  電子轟擊粒子源，電離能量為70 eV;離子源溫度為230 ℃;傳輸線(xiàn)溫度為210 ℃;四級(jí)桿溫度為150 ℃。 
　　1.6  樣品的處理 
　　分別將艾納香愈傷組織、艾納香組培苗、野生苗3種樣品用研缽粉碎，稱(chēng)取粉碎樣品8 g，放至250 mL的錐形瓶中，加無(wú)水乙醇100 mL，進(jìn)行聲提?。晻r(shí)間為120 min，頻率為59 Hz，功率為80%），冷卻、搖勻、過(guò)濾，濾液置于100 mL容量瓶中，放冷，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，從100 mL容量瓶中再取1 mL溶液，置10 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，即為樣品溶液。 
　　1.7  龍腦對(duì)照品的氣質(zhì)聯(lián)用分析 
　　分別從0.03 mg/mL的龍腦對(duì)照品溶液及樣品溶液中精密量取1 μL溶液，運(yùn)用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定。 
　　1.7.1  標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制  分別精密吸取濃度為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的龍腦對(duì)照品溶液各1 μL，依次進(jìn)樣，運(yùn)用氣質(zhì)聯(lián)用儀分別測(cè)定其峰面積，以龍腦對(duì)照品的峰面積為縱坐標(biāo)，龍腦對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 
　　1.7.2  精密度測(cè)定  取濃度為0.03 mg/mL的龍腦對(duì)照品溶液1 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)峰面積計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。 
　　1.7.3  重復(fù)性試驗(yàn)  取艾納香野生苗，按照樣品溶液制備方法配制6份100 mL的溶液，根據(jù)氣質(zhì)聯(lián)用法依次對(duì)6份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄樣品的峰面積，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。 
　　1.7.4  加標(biāo)回收率試驗(yàn)  分別稱(chēng)取艾納香組培苗和貴州羅甸野生苗各0.04 g，制備成樣品溶液，從中各取出6份，先測(cè)出藥材中龍腦的含量，再向每份中加入0.300 mg龍腦對(duì)照品，由氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定6個(gè)樣品峰面積，計(jì)算平均回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。 
　　1.7.5  樣品含量的測(cè)定  分別量取愈傷組織供試品溶液、組培苗供試品溶液和野生苗供試品溶液各1 μL依次進(jìn)樣，測(cè)定出峰面積，計(jì)算供試品溶液中龍腦的含量，每份平行測(cè)定3次。
　　2  結(jié)果與分析 
　　2.1  龍腦對(duì)照品溶液及樣品溶液氣質(zhì)聯(lián)用分析 
　　從0.03 mg/mL的對(duì)照品溶液及樣品溶液中精密量取1 μL溶液進(jìn)樣，從圖1至4可以看出，龍腦標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間在7.621 min;樣品色譜圖在7.621 min有一吸收峰與龍腦標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致;質(zhì)譜圖檢索結(jié)果為龍腦成分。 
　　2.2  線(xiàn)性關(guān)系分析 
　　以龍腦的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)表1、圖5，計(jì)算回歸方程為：y=173.602 5 x，R2為0.997 01。結(jié)果表明，龍腦在0.02～0.06 mg/mL內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（n=5）。 
　　2.3  精密度測(cè)定結(jié)果 
　　由精密度試驗(yàn)方法，用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.44%。表明方法的精密度良好。 
　　2.4  重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 
　　根據(jù)重復(fù)性試驗(yàn)考察方法，由氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。 
　　由表3可得，6份供試品溶液中龍腦平均含量為3.621 6 mg/g，RSD為0.16%，表明方法的重復(fù)性好。 
　　2.5  加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果 
　　測(cè)得組培苗中龍腦的平均回收率97.11%，RSD為1.14%;野生苗中龍腦的平均回收率97.78%，RSD為0.67%，表明該方法的度高（表4）。 
　　2.6  樣品含量的測(cè)定 
　　從表5可以得出艾納香組培苗中龍腦的平均含量為3.216 7 mg/g，貴州羅甸艾納香野生苗中龍腦的平均含量為3.620 0 mg/g。 
　　3  小結(jié)與討論 
　　在擬定的色譜條件下，以無(wú)水乙醇作為艾納香中龍腦的提取溶劑，采用聲提取，簡(jiǎn)化了樣品的制備方法，而且艾納香中龍腦的含量測(cè)定沒(méi)有受到其他成分的干擾。氣質(zhì)聯(lián)用儀用于檢測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)靈敏度高、度好。運(yùn)用該方法，在對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液中，色譜圖中龍腦出峰的時(shí)間在7.621 min，愈傷組織的色譜分析顯示，在該時(shí)間處沒(méi)有吸收峰，這說(shuō)明愈傷組織中不存在龍腦。組培苗、羅甸野生苗質(zhì)譜圖分析確定是龍腦，其中組培苗中龍腦的含量較野生苗低，但差異不大，原因可能是組培苗培養(yǎng)時(shí)間較短，龍腦在植物體內(nèi)有一個(gè)逐步累積的過(guò)程。但組培苗可以人工快速培育繁殖，縮短培育周期，為艾納香藥材應(yīng)用提供的苗木，以滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。